真菌表达载体怎么构建？

设计引物加接头，扩增目的基因，连接到T载体上测序。正确无误，切下来，酶切载体质粒与目的基因连接，阳性克隆鉴定，测序无误后构建完毕

载体构建

一．原理

依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体

DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

二．操作步骤

1． 摇菌

取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2． 提质粒

依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3． 酶切

按下表加入试剂。

反应所需试剂 体积（单位：ul）

质粒 10

所需内切酶反应缓冲液 2

所需限制性内切核酸酶 1

H2O 7

将加好的EP管置于37℃保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）

4． 电泳检测

将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。

5． 连接

如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接，连接体系如下：

双蒸水 5μL

10×T4 DNA连接缓冲液 1μL

载体 2μL

酶切后的目的基因 1μL

T4DNA连接酶 1μL

总体积 10μL

置于温箱，12-16℃，保温8-16h

6． 转化

依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，

12-16h。

7． 单克隆检测

（1）挑单克隆

先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的

AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。

（2）单克隆检测

以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μL，加到3ml（有LB液体培养液，AMP+）试管中，过夜摇；第二天重摇，将摇好的菌取1ml于1.5mlEP管中送测序，并保种。

注：

①挑单克隆时，一定要挑单一圆润的菌落，有卫星斑的不挑。

②别忘记往培养基中加AMP。

③用接种环挑菌后，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下一次挑菌。

三．注意事项

1． 连接产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续实验；

2． 在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间；

3． 连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参数之一就是温度，因此要控

制好连接温度。

4．进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制DNA片段的自身环化。

参考：

1. 刘进元，常智杰，赵广荣,等.分子生物学实验指导[M].北京:清华大学出版社，2002

2. 周俊宜.分子生物学基本技能和策略[M].北京：科学出版社，2003：

117-120

3. 李海英，杨峰山，邵淑丽,等.现代分子生物学与基因工程[M].北京:化学工业出版社，2008:138-142

4. 朱旭芬.基因工程实验指导[M].北京：高等教育出版社，2006:134-139