南京农业大学生命科学学院（文章解读）

2020年2月5日，南京农业大学生命科学学院谢彦杰课题组在植物学著名期刊《The Plant Cell》发表了题目为：“Persulfidation-based Modification of Cysteine Desulfhydrase and the NADPH Oxidase RBOHD Controls Guard Cell Abscisic Acid Signaling”的论文。文章揭示了硫化氢（H2S）通过自体巯基化，以及巯基化NADPH氧化酶RbohD，参与了ABA诱导的活性氧（ROS）信号和气孔运动过程。

南京农业大学 谢彦杰课题组

文章摘要：

越来越多的证据表明，硫化氢（H2S）这种气体信号分子，可以通过巯基化调节不同的细胞信号通路，这涉及到特定半胱氨酸残基的蛋白质翻译后修饰（PTM）以形成过硫化物。然而，这种重要的基于氧化还原的PTM的机制在高等植物中仍然鲜为人知。因此，作者已经分析了蛋白质过硫是如何在植物脱落酸（ABA）反应中作为一种特定和可逆的信号机制的。实验发现ABA以氧化还原依赖的方式巯基化一种重要的内源性H2S酶——L-半胱氨酸脱硫酶1（DES1），巯基化位点在Cys44和Cys205。此外，持续的H2S产生，可以使NADPH氧化酶RBOHD在Cys825和Cys890发生巯基化修饰，从而提高了其产生活性氧的能力。生理水平上，S-巯基化诱导的RBOHD活性与ABA诱导的气孔关闭有关，这些过程一起形成了一个负反馈回路，精确的调节氧化还原稳态和ABA信号。这些发现不仅扩大了我们目前在保卫细胞ABA信号背景下H2S功能的认知，而且还揭示了一种快速信号集成机制的存在，它涉及到特定的、可逆的、基于氧化还原的PTMs。这些机制也解释了为什么植物可以对不断变化的环境条件的原因。

背景介绍：

ABA（脱落酸）作为植物的经典五大激素之一，植物学领域对其研究已经较为详尽，除了在种子休眠、种子萌发、植物发育中的作用外，最为主要的就其对包括干旱，高温等非生物胁迫的响应，因此也被称为“抗逆素”。这个过程离不开ABA所特异性调控的保卫细胞的气孔运动过程。

ABA参与的信号通路网络图

活性氧（ROS），顾名思义是生物体内氧在活跃价态的所有物质的总称，例如：H2O2，O2-等。在植物中ROS的产生离不开NADPH氧化酶（Rboh）的存在，模式植物拟南芥中总共有10多种Rboh的存在，而在植物保卫细胞中特异性存在的主要是RbohD和RbohF，双突对ABA信号极度不敏感。ABA诱导的气孔关闭过程通常伴随着活性氧（ROS）的迅速大量产生，ROS在保卫细胞中作为第二信使诱导气孔关闭。质膜定位的NADPH氧化酶RBOHD和RBOHF是保卫细胞信号传导途径的重要元件，他们介导了气孔关闭过程中ROS的产生。

硫化氢（H2S）一直被认为是一种有毒气体，作为第三种气体信号分子，H2S在生物体中的生理功能逐渐被揭示。 植物中 H2S 信号研究在不到 10 年时间已取得了长足进步。 植物体内 H2S 的生成酶比动物细胞丰富，定位于细胞质、线粒体和叶绿体等多个亚细胞部位，表达具有时空性。近来，H2S可以通过直接巯基化的方式调控蛋白活性的报道越来越多。

由H2S和NO介导的硫醇修饰

结果解析：

1.ABA引起DES1的活性和巯基化：

根据组蛋白巯基化分析，猜想DES1可以被巯基化修饰，利用cyan-biotin和特异抗体免疫检测。发现NaHS可以增加DES1的巯基化水平，同时可以被DTT（翻译阻断剂）去除。为了确定这个巯基化是否发生在保卫细胞中，作者构建了pMYB60:DES1-GFP des1的转基因株系，一方面发现随着NaHS含量升高，DES1巯基化增加，同时确定ABA诱导后10min作用保卫细胞内巯基化水平开始显著提升。

巯基化调控DES1功能活性

2.氧化还原对DES1巯基化和酶活性的调节：

除了酶活之外，巯基化另一个特征就是可以和双电子氧化剂发生剧烈反应，例如H2O2。作者利用检测了外源H2O2对DES1巯基化的影响：发现随着H2O2的增加，保卫细胞中DES1巯基化水平剂量性下降。同时DPI（黄素酶抑制剂）可以显著提高DES1巯基化水平，rbohD突变体中DES1巯基化更高。进一步说明了：保卫细胞中DES1的巯基化修饰可以被ABA诱导的RbohD产生的ROS所氧化。

氧化巯基化对DES1的调节作用

3.Cys44和Cys205位点上，DES1的巯基化是ABA刺激活性和气孔关闭的先决条件：

通过质谱分析,在DES1可能的三个巯基化位点中C44和C205可以发生巯基化。通过点突变将Cys变为Ala,巯基化检测发现，C44突变后DES1巯基化水平减弱，而C205突变后DES1巯基化几乎检测不到。

DES1 Cys44,205巯基化调控了ABA诱导的气孔关闭

进一步利用此突变的DES1进行分析DES1酶活，H2O2氧化抑制，H2S产生，气孔导度，气孔H2S含量。都发现C44和C205的突变使之与WT发生显著的变化。这也说明了C44，C205这两个位点在DES1巯基化的功能中起到了关键的作用。

DES1 Cys44,205巯基化调控了ABA诱导的气孔关闭

4.保卫细胞中产生的ROS的RBOHD是DES1调控的气孔关闭所必需的基因

ROS的积累参与调控了植物自身免疫的过程，ROS的积累有组织特异性。构建了（pMYB60=GC， pML1=epidermal， pCAB3=MP） 的rbohD组织特异性回补材料。

气孔Bioassy实验和H2O2流量监测，发现rbohD突变体ROS缺失的表型可以被表皮和保卫细胞表达的RbohD回补。des1&rbohD双突中对ABA和NaHS诱导的气孔关闭显著变得迟缓。

说明了：有功能的DES1参与了ABA引起的气孔关闭过程中保卫细胞内ROS的积累和信号传递。

H2S需要RBOHD活动诱导气孔关闭

5.H2S激活RBOHD的NADPH氧化酶活性：

在不同的H2S供体盐溶液的诱导下，NADPH氧化酶的活性在WT和des1都有所增加，des1中相对低一些。而在rbohD中NaHS并不能改变NADPH氧化酶酶活。

这说明RbohD在H2S诱导的NADPH氧化酶活性中起主要作用。

NADPH氧化酶酶活检测

6.ABA诱导的RBOHD在Cys825和Cys890上发生巯基化作用

RbohD包含了10个cys的巯基化位点，首要考略的是包内结构域，发现NaHS,Na2S,ABA诱导下其C端可以被巯基化，N端不可以。

对于RbohD巯基化而言，当突变了其C端的C825,C890为Ala后，巯基化水平显著降低，特别是C825最为显著。说明C端的C825和C890是主要的巯基化位点。

通过序列比对，Rboh家族的多数基因C端较为保守，验证其中的RbohC也能发生类似的巯基化。

ABA诱导的RBOHD在Cys825和Cys890上发生巯基化作用

7.RbohD的巯基化控制ABA引起的活性氧产生和气孔关闭：

为了确定RbohD巯基化参与了ABA诱导的ROS变化和气孔运动。构建了自身启动子的遗传材料。

对于Rboh的Cys->Ala的单突和双突而言，NADPH氧化酶活性显著降低。在rbohD突变体背景转基因材料中，ABA/H2S诱导的ROS含量在点突变体中都低于对照，同样诱导的气孔关闭中点突响应更加迟钝。在rbohD des1双突背景转基因材料中，ABA/H2S的ROS均减低，气孔运动响应更加迟缓。

这也说明了：DES1/H2S对RbohD的巯基化在ABA诱导的ROS产生和气孔运动中起关键作用。

DES1巯基化RbohD的过程参与了ABA诱导的ROS激活和气孔关闭。

文章总结：

当干旱胁迫信号被植物感知时，ABA被合成，并通过未知的机制在保卫细胞中触发DES1的快速和强表达。

诱导DES1的表达可以巯基化许多下游信号蛋白，包括DES1自身的Cys44和Cys205，并引起保卫细胞H2S信号的放大。

诱导的DES1/H2S还巯基化NADPH氧化酶RBOHD的Cys825和Cys890，以促进ROS突发的快速诱导，进而导致气孔关闭。

当ROS积累到高水平时，它进一步导致RBOHD和DES1（-SSOnH）的巯基氧化，是的对ABA不再敏感。

氧化的巯基（-SSOnH）随后可能被硫氧还蛋白还原为硫醇基团（-SH），这形成了一种在保卫细胞中确保可以持续激活的ABA信号的反馈策略。

原文链接：http://www.plantcell.org/content/early/2020/02/05/tpc.19.00826